تاثیر عصاره بدن کرم خاکی قرمز بر ترمیم زخم بخیه در ماهی طلایی (carassius auratus)

روند ترمیم زخم (wound healing)فرآیندی ترمیمی بوده که به تدریج در ساختار منطقه آسیب دیده خود را نشان می دهد. پس از ایجاد زخم، واکنش های التهابی شدیدی در آن محل شروع به فعالیت نموده و سپس با افزایش تولید رشته های کلاژن بافت پیوندی و پس از آن بازسازی و بازآرایی (rearrangement) اپی تلیوم ترمیم و بهبود زخم به اتمام خواهد رسید. این روند از جمله روندهای بسیار ظریف و دقیق فیزیولوژیکی بوده و از اهمیت بسیار زیادی در اصول پزشکی (درمان زخم های دیابتی و جراحی) و دامپزشکی (درمان زخم در سطح بدن ماهیان زینتی اکواریومی و نیز ماهیان خاویاری) برخوردار است. علاقه و توجه به درمان هر چه بهتر زخم در ماهیان زینتی که بعضا از ارزش اقتصادی زیادی نیز برخوردار هستند، رو به افزایش بوده، لذا در این میان انتخاب درمان های مناسب تر و در عین حال موثرتر، بسیار مورد توجه محافل علمی قرار دارد (1). درمان زخم های عفونی پس از جراحی در بسیاری از ماهیان زینتی (ornamental) نظیر ماهی طلایی و دیگر ماهیان با ارزش اکواریومی و نیز ماهیان خاویاری بسیار رایج بوده و به کاهش میزان مرگ و می در این ماهیان کمک زیادی می نماید. این زخم های عفونی بیش تر در نواحی باله ها و سر ماهی مشاهده شده که بدون درمان لازم معمولا موجب از کار افتادگی ماهی خواهد شد. برای مثال می توان به بیماری باکتریایی پوسیدگی باله های یا fin rot اشاره نمود که در طی آن باکتری فلاوباکتریوم کلومناره به بافت مورد نظر حمله ور شده و زخم های شدیدی را ایجاد می کند. برای درمان اولیه حتما می بایست بخش عفونی را جراحی نموده و قطع نماییم. در بسیاری از موارد نیز زخم هایی در اثر جابجایی نادرست و غیر اصولی ماهیان ایجاد شده که هجوم میکروبی از نوع آئروموناس آن را تشدید می کند. در هر حال موارد ذکر شده نیاز به ترمیم موثر و سریع زخم دارند (2). تومورهای خارجی در سطح بدن ماهیان نیز نیاز به جراحی و سپس ترمیم زخم موثر دارند (3). گاه مشکلات شناوری در ماهیان و یا بیماری های شدید چشمی نیز نیازمند جراحی فوری و موثر بوده و ترمیم زخم های عارض شده در آنان نیز بسیار مورد توجه می باشد (4 و5). یکی از موارد بسیار مورد توجه در علم آبزی پروری نحوه برداشت خاویار از ماهیان خاویاری است. سابق بر این ماهی خاویاری ماده با عمر حدود 6 تا 7 سال را کشته و سپس اقدام به خارج سازی تخم ها یا همان خاویار از شکم ماهی می نمودند، اما در سال های اخیر با روش جراحی شکم و سپس ساکشن خاویار، دیگر نیازی به کشتن ماهی مادر نبوده و می توان دوباره این ماهی را پس از درمان و ترمیم مناسب زخم در آب های آزاد رها نمود. البته همیشه محیط زندگی ماهیان دربردارنده انواع عفونت ها و میکروب ها بوده که این خود تاثیر منفی در جریان ترمیم زخم بر جای می گذارد. لذا در این خصوص چنان چه بتوان از عصاره بدن کرم خاکی در تیمار و درمان موثر زخم در ماهیان خاویاری استفاده نمود، کمک زیادی به رونق اقتصادی در کشورهایی مثل ایران خواهد شد. از جمله بی مهرگان خاکزی کرم های خاکی بوده که واجد تشخیص ایمونولوژیکی و حافظه ای هستند. این جانوران قادر به ترمیم بافت های از دست رفته بدن خود بوده و در محیط های بسیار آلوده با میکروب ها توان زیست و تکثیر دارند. ماکرومولکول های موجود در ترکیب شیمیایی مایع سلومی کرم های خاکی مسول این پایداری و مقاومت در شرایط سخت می باشند. اثرات زیستی این نوع از ماکرومولکول ها در یک دوره زمانی طولانی در حدود 600 میلیون سال قبل تا حال? تقریبا به صورت ثابت در بیش تر بی مهرگان باقی مانده است (6 و7). از میان ترکیبات مختلف بدن (درون مایع سلومی و لوله گوارش) کرم های خاکی? کمپلکس گلیکولیپوپروتیینی g90 دارای خواص متفاوتی نظیر: اثرات آنتی اکسیدانی? ضد باکتریایی و میتوژنیک (محرک رشد در روند ترمیم زخم) می باشد. میزان محتوی پروتیینی موجود در ساختار g90 مستخرج از عصاره ی بدن کرم خاکی آیزنیا فتیدا در حدود 40 میکروگرم در هر میلی گرم آن می باشد. در ساختار g90 گروه های آمینی به همراه با قندها و گلوکولیپیدها وجود دارند. تیمار زخم موش ها با g90، سبب افزایش مقدار برخی از فاکتورهای رشد در پوست محل زخم می شود. g90 با عمل آنتی اکسیدانی خود موجب مقاومت اپی تلیوم در برابر آسیب های اکسیداتیو ناشی از رادیکال آزاد اکسیژنی می شود (8 و9). 3- اهداف اصلی طرح : در پژوهش حاضر به بررسی اثر ترمیم کننده کمپلیکس g90 از عصاره بدن کرم خاکی بر ساختار زخم بخیه در سطح بدن ماهیان طلایی می پردازیم. هم چنین همراه با این اثر، تاثیر توام خورانش پودر (آرد) کرم خاکی (به عنوان جزیی از غذای روزانه ماهی) در طی دوره زمانی 14 روزه ترمیم زخم، مورد بررسی قرار خواهد گرفت. 4- ارائه فرضیات : h0: به کارگیری غلظت های مشخص از عصاره بدن کرم خاکی (کمپلکس g90)، با یا بدون خورانش پودر کرم خاکی، باعث بهبود بهتر و سریع تر زخم های بخیه دار در ماهیان طلایی نمی شود. h1: به کارگیری غلظت های مشخص از عصاره بدن کرم خاکی (کمپلکس g90)، با یا بدون خورانش پودر کرم خاکی، باعث بهبود بهتر و سریع تر زخم های بخیه دار در ماهیان طلایی می شود. 5- پیشینه تحقیق و بررسی منابع : تا کنون هیچ اطلاعاتی در زمینه ترمیم زخم بخیه ها به کمک عصاره بدن کرم های خاکی در ماهی ها در منابع معتبر علمی دنیا در دسترس نبوده و این تحقیق برای اولین بار به انجام می رسد. لذا از نظر پیشینه تحقیق اطلاعات خاصی در دسترس نبوده و تمامی موارد مورد نظر در تحقیق حاضر به صورت پیشنهادی می باشند. در سال 2010 نعمت اللهی و همکارانش نشان دادند که نوع بخیه در بهبود بهتر و موثرتر محل زخم در جراحی های ماهی طلایی نقشی اساسی را ایفا نموده و دراین میان بخیه ی نوع ساب کوتیکولار بهترین نتیجه را به دنبال داشته است (10). این نتیجه بیانگر این مطلب است که علاوه بر کاربرد ترمیم کننده مناسب? استفاده درست از نوع بخیه زدن نیز در اجرای بهتر روند ترمیم و بهبود زخم ها موثر خواهد بود. علاوه بر این? حتی نوع نخ بخیه نیز در هموار سازی سطح نهایی زخم و کاهش التهابات بعدی مهم بوده به طوری که مشخص شده کاربرد نخ های پلی گلیکولیک نسبت به نخ های کات کوت ساده و کرومیک ارجح تر می باشد (11). در ارتباط با اثر عصاره بدن کرم های خاکی (g90) در روند ترمیم زخم ها، کارهای اندکی به انجام رسیده و در واقع این خط تحقیقاتی مراحل اولیه پیشرفت خود را طی می کند. در سال 2001 مشخص گردید که عصاره بدن کرم های خاکی (g90) واجد خاصیت های آنتی اکسیدانی و ضد باکتریایی بوده و بدین تربیب می تواند به عنوان یک کاندید مناسب در فرایند ترمیم زخم جانوران در نظر گرفته شود (12 و13). در همین راستا نشان داده شده که g90 با دارا بودن مولکول های مشابه با igf ها واجد القاء قدرت تکثیر در محیط های کشت سلولی می باشد (14). خاصیت های آنتی اکسیدانی g90 موجب افزایش در رشد و تکثیر فیبروبلاست ها و سلول های اپی تلیالی می شود (12). اجزای درون ساختار g90 با افزایش میزان قدرت پروتیین های اتصالی برخی سلول ها موجب افزایش توان ایمنی سلولی می شوند (13). اخیرا نیز نشان داده شده که پودر کرم خاکی آیزنیا واجد قدرت ضد قارچی شدید بوده و به آن این امکان را خواهد داد که در فرایندهای مرتبط با التیام زخم ها مشارکت جوید (15). برای اولین بار grdisa و همکارانش جهت ترمیم زخم در مدل های جانوری اقدام به استفاده از عصاره بدن کرم های خاکی نمودند (13). اینان مشخص نمودند که چنان چه عصاره بدن کرم خاکی به کار گرفته شود? تا حد زیادی مراحل بهبود زخم پوستی در موش ها به جلو می افتد. مکانیسم اصلی این اثر مثبت در ارتباط با افزایش برخی فاکتورهای رشد در طی مراحل بهبود زخم می باشد. آزمایشات ایمونوهیستوشیمی و باکتری شناسی نیز نشان دادند که بهبود زخم در سطح بسیار مناسب و رضایت بخشی قرار داشته است (8). همین گروه (9) در سال 2010 نشان دادند که کاربرد g90 موجب کاهش جمعیت های میکروبی در محل زخم شده و هم چنین عنوان داشتند که g90 موجب کاهش زمان مرحله التهاب و سرعت بخشی به مراحل تکثیر سلولی در درمان زخم های موش های رت می شود. در همین مقاله پیشنهاد شده که ماده g90 به عنوان یک کاندیدای مناسب در درمان زخم ها در دامپزشکی و آبزی پروری مورد کاربرد زیاد خواهد داشت. 6- مواد و روش اجرا : الف- تهیه ی عصاره بدن کرم خاکی و استخراج کمپلکس g90 : بدین منظور از روش استخراج پیشنهاد شده توسط هرزنجاک و همکارانش در سال 1992 (12) استفاده می شود. به طور خلاصه، پس از خارج سازی محتویات روده ای کرم های خاکی قرمز (lumbricus rubella) (تهیه شده از شرکت سروش محیط سبز- مستقر در مرکز رشد واحد های فناوری دانشگاه شهرکرد) اقدام به خرد و له کردن کرم ها نموده و پس از هوموژنیزاسیون به کمک محلول حلال کمپلکس مورد نظر با رنگ سفید تا کرمی رنگ قابل جداسازی است. در آخر به کمک روش خشک کردن انجمادی، کمپلکس مورد نظر به فرم پودر محلول در آب یون زدایی شده، در خواهد آمد. این کمپلکس در دو دوز مختلف (50 نانوگرم و 50 میکروگرم در میلی لیتر حلال) در یک پماد با پایه چربی حل شده و روزانه بر روی محل زخم های بخیه دار مورد استفاده قرار خواهد گرفت. ب- تهیه پودر (آرد) کرم خاکی: در این قسمت ابتدا با شوک الکتریکی مایع سلومی را از بدن کرم ها خارج نموده و سپس کرم ها در نور آفتاب خشک و بعد از آن آسیاب نموده و پودر نهایی با دوز 5 درصد در غذای ماهیان وارد خواهد شد. ت- مدل جانوری، ایجاد زخم و تیمار با کمپلکس g90: جانوران بالغ مورد استفاده، ماهیان طلایی (goldfish) با نام علمی carassius auratus بوده که از کارگاه های تولید ماهیان طلایی در اصفهان تهیه خواهند شد. این جانوران پس از فراهم آوردی شرایط لازم جهت تطابق با محیط، مورد استفاده قرار می گیرند. ماهیان مورد نظر در 6 گروه (در هر گروه حداقل 8 ماهی) قرار خواهند گرفت: 1- گروه شاهد منفی (بدون زخم بخیه دار و بدون تیمار با پماد) با زندگی معمولی در اکواریوم. 2- گروه اول تجربی (واجد زخم بخیه دار و بدون درمان با پماد) (= گروه شم) که ترمیم زخم در آن به طور طبیعی به انجام می رسد. 3- گروه دوم تجربی (واجد زخم بخیه دار و درمان توسط دوز اول پماد) . 4- گروه سوم تجربی (واجد زخم بخیه دار و درمان توسط دوز دوم پماد) . 5- گروه چهارم تجربی (واجد زخم بخیه دار + درمان توسط دوز اول پماد + خورانش خوراک حاوی پودر کرم خاکی). 6- گروه پنجم تجربی (واجد زخم بخیه دار + درمان توسط دوز دوم پماد + خورانش خوراک حاوی پودر کرم خاکی). غذای کنسانتره تجاری به میزان مناسب (یک تا دو بار در روز) در اختیار جانوران قرار داده خواهد شد. دمای مورد نظر دمای اتاق °c 1±22 بوده و دوره روشنایی 12-12 نور- تاریکی را در نظر می گیریم. دو هفته قبل از شروع کار ماهیان را در تانک های شیشه ای آکواریومی 60 لیتری وارد نموده و از آب شهری برای تعویض آب ظروف استفاده خواهد شد. دمای آب اکواریوم ها بین 20 تا 25 درجه سانتی گراد حفظ خواهد گردید. جهت ایجاد زخم های تجربی، ابتدا ماهی را به کمک محلول بنزوکایین (mg/l 100) بیهوش نموده و پس از خارج سازی از ظروف اکواریوم به کمک وسایل جراحی، برشی به طول حدود 2 سانتی متر و با عمقی تا درون حفره شکمی (در خط میانی شکم) جانور ایجاد می کنیم. در مرحله بعد محل بریدگی را بخیه می زنیم. سپس ماهی بیهوش شده را در یک تانک آب 20 لیتری با هوادهی تازه قرار داده تا بیهوشی بر طرف گشته و بتوان ماهی را به محل اصلی زندگی اش باز گردانید (10). تیمارهای روزانه با پماد حاوی g90 صورت خواهد گرفت. در انتهای دوره زمانی 14 روزه، ماهی ها را خارج نموده و نمونه های لازم جهت انجام آزمایشات مندرج در ذیل از آنان برداشت خواهد شد : ت-1) بررسی های ماکروسکوپی (مورفومتریک) : ارزیابی میزان جمع شدگی سطح خارجی (انقباض) زخم ها (wound contraction) به کمک کولیس دیژیتالی در زمان های مختلف تعیین شده و در همین راستا نیز میزان درصد بهبودی زخم ها (wound healing percentage) مشخص خواهد گردید (9). ت-2) بررسی های میکروسکوپی (تغییرات هیستوپاتولوژیکی) نمونه های بافتی: در این قسمت قطعه ای بافتی حدود 5 میلی متر را برداشت نموده که پس از مراحل فیکساسیون و قالب گیری از نمونه ها برش های 5 میکرونی از آنان تهیه شده و در آخر نیز به کمک روش h&e رنگ آمیزی می کنیم. این برش ها از نظر وجود و یا عدم وجود نکروز و التهاب و نیز وسعت باز آرایی های (rearrangements) سلولی و بافتی مورد بررسی قرار خواهند گرفت (16). ت- 3) اندازه گیری فعالیت لیزوزیمی (ایمنی ذاتی) در سروم خون ماهیان طلایی به روش لیزوپلیت: در این قسمت از کار به بررسی این فعالیت آنزیمی به عنوان یکی از شاخص های تعیین کننده میزان فعالیت سیستم ایمنی در خون ماهی می پردازیم. در این روش فعالیت بیش تر لیزوزیم خونی معادل با رشد کم تر در کلونی های باکتریایی در محیط کشت بوده و با مقایسه میزان رشد و یا عدم رشد کلونی ها می توان به میزان حضور لیزوزیم در نمونه های سروم خون پی برد (17). ت- 4) ارزیابی میزان تولید محصولات نهایی روند پراکسیداسیون لیپیدها (tbars) در خون- با سنجش میزان مالون دی آلدیید (mda) تولید شده و بررسی میزان واکنش آن با اسید تایو باربیتیوریک در نمونه های بافتی، می توان به میزان گسترش پراکسیداسیون لیپیدی در بافت مورد نظر پی برد. این سنجش با روش اسپکتروفوتومتری و در طول موج 532 نانومتر به انجام می رسد (18). ث: تجزیه و تحلیل داده ها- تمامی داده ها به صورت means±standard deviation (sd) نمایش داده خواهند شد. جهت مقایسه آماری بین گروه ها از روش آماری one way-anova و پس آزمون tukeys hsd و به منظور مقایسه میانگین داده ها (مقایسه تیمارها با شاهد) از آزمونstudents t-test استفاده خواهد شد. جهت کار نرم افزار spss (ویراست 16) مورد استفاده قرار می گیرد. سطح 05/0p< از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته خواهد شد. ج: کلیه مواد شیمیایی (با حداکثر خلوص) و وسایل مورد نیاز با سفارش به شرکت های داخلی تهیه خواهند شد.